Публікація статей丨Покращена-ШІ мікрофлюїдна платформа CRISPR-Cas14a для точного-виявлення гемінівірусів у рослинах помідорів і білокрилки на місці

Гемінівіруси становлять серйозну загрозу світовому виробництву томатів через швидку еволюцію та поширення білокрилок у всьому світі. Сучасні методи виявлення в першу чергу спрямовані на симптоматичні рослини, часто забезпечуючи діагностичні результати лише після того, як вірусне навантаження досягне трансмісивного рівня, що робить боротьбу з хворобою неефективною. Раннє втручання залежить від виявлення інфекцій до появи симптомів-або навіть виявлення присутності вірусу в комахах-переносниках до того, як вони передадуть віруси рослинам. Незважаючи на те, що нещодавні досягнення в області ізотермічної ампліфікації та діагностики на основі CRISPR- пропонують потенційні рішення, практична реалізація стикається з властивими обмеженнями: несумісністю між системами ферментативної ампліфікації та CRISPR, ризиком забруднення через багатоетапні процедури та неадекватною польовою адаптацією пристроїв виявлення. Щоб вирішити ці проблеми, ми розробили MaC14a-покращену мікрофлюїдну платформу зі штучним інтелектом-, яка об’єднує асиметричну мультиензимну ізотермічну швидку ампліфікацію (aMIRA) з CRISPR-Cas14a. Ця система долає ключові технічні бар’єри, оптимізуючи стехіометрію праймера для генерації оцДНК для PAM-незалежної активації Cas14a, досягаючи ультрачутливого виявлення (10 фМ), одночасно усуваючи перехресне-забруднення через реакції в одній-пробірці. У поєднанні з відцентровим мікрофлюїдним чіпом, портативним оптичним детектуванням і інтерпретацією сигналів на основі-машинного навчання MaC14a забезпечує мультиплексне виявлення чотирьох гемінівірусів протягом 5 хвилин, демонструючи 100% точність діагностики як для зразків рослин, так і для зразків білокрилки. Його досягнення включають: (i) передсимптомне виявлення інфекції в рослинах і (ii) точне визначення носія вірусу в окремих білокрилок-, що заповнює критичну технологічну прогалину в нагляді перед-передачею. Окрім створення нового інструменту для боротьби з гемінівірусами, це дослідження створює парадигму «AI-CRISPR-microfluidics» для захисту рослин. Зміщуючи фокус з симптоматичних рослин на віруліферні вектори та безсимптомні інфекції, ця технологія пропонує трансформаційне рішення для порушення циклів передачі вірусу в їх джерелі.

Інтегрований робочий процес системи MaC14a для мультиплексного нагляду за гемінівірусами.

(A) Механізм aMIRA-Cas14a-опосередкованого виявлення нуклеїнової кислоти. Схематично ілюструє ампліфікацію оцДНК, керовану aMIRA-, у поєднанні з незалежним розпізнаванням оцДНК PAM Cas14a та активністю колатерального розщеплення, що дозволяє виявити одну-пробірку (сумісну з-інструментами флуоресцентної ПЛР у реальному часі) або-мікрофлюїдний аналіз на місці (через-спеціальний-розроблений відцентрові пристрої виявлення). (B) Робочий процес мікрофлюїдного виявлення (MaC14a) для польової-діагностики, що розгортається. Часові кроки позначено стрілками, що показують тривалість кожного процесу в портативному аналізаторі. (C) Блок-схема алгоритму-виявлення в реальному часі на основі мереж довгострокової-термальної пам’яті (LSTM). Оптимізований алгоритм полегшує-обробку сигналів флуоресценції в реальному часі, дозволяючи інтерпретувати результат протягом 5–10 хв.

Система виявлення aMIRA-Cas14a

(A) Схематична діаграма ілюструє механізм реакції платформи виявлення aMIRA-Cas14a. (B) Специфічну активність розщеплення Cas14a на продукти aMIRA перевіряли за допомогою аналізу гель-електрофорезу (C) Порівняльний аналіз одно-етапного та дво-етапного методів виявлення aMIRA-Cas14a. Примітка: у дво-протоколі реакції процес починається з 20-хвилинної ампліфікації aMIR, після чого додається система виявлення Cas14a для моніторингу флуоресценції. Отже, збір сигналів флуоресценції починається через 20 хвилин. (D) і (E) Були проведені експерименти з оптимізації, щоб визначити оптимальне співвідношення прямого і зворотного праймерів. (F–I) Специфічність системи aMIRA-Cas14a підтверджено шляхом виявлення чотирьох різних вірусних мішеней (TYLCCNV, TYLCV, TOLCNDV і TbCSV) у зразках рослин. Змішаний зразок (позначений як Mix) готували шляхом поєднання рівних об’ємів кожного препарату вірусної ДНК.

Щоб досягти ампліфікації сигналу для слідових кількостей вірусних нуклеїнових кислот і забезпечити достатню кількість субстратів для Cas14a, ми розробили aMIRA (асиметричне багатоферментне ізотермічне швидке посилення) на основі MIRA. Отримана система aMIRA-Cas14a пропонує такі ключові переваги:

1. Оптимізована стехіометрія праймера дозволяє MIRA переважно надлишково продукувати оцДНК, яка служить прямим субстратом для Cas14a. Регулюючи співвідношення прямого-до-зворотного праймерів до 20:1, система генерує достатню кількість оцДНК для активації PAM-незалежної активності розщеплення Cas14a, який спеціально розпізнає та розщеплює оцДНК.
2. Інтеграція MIRA та CRISPR-Cas14a в один резервуар усуває ризики перехресного зараження.
3. MIRA значно підвищує чутливість виявлення, дозволяючи виявляти вірусні нуклеїнові кислоти з наднизьким вмістом.
4. aMIRA-Cas14a підтримує високу специфічність, уникаючи помилкових позитивних результатів, спричинених неспецифічною ампліфікацією.

Зрештою, єдина інтеграція MIRA та CRISPR-Cas14a усуває ризики забруднення та забезпечує ідеальну синергію між сильними сторонами MIRA та системою CRISPR-Cas14a. Це вирішує загальногалузеву проблему несумісності ізотермічного підсилення та систем CRISPR, що є основним технологічним проривом платформи MaC14a. Система aMIRA-Cas14a досягає 1000-кратного підвищення чутливості, забезпечуючи специфічне посилення. У поєднанні з розпізнаванням послідовності Cas14a це забезпечує подвійну перевірку специфічності без перехресної реакції на нецільові віруси чи здорові зразки-, що усуває іншу галузеву проблему: тенденцію до хибних спрацьовувань.

Мультиферментні ізотермічні реагенти для швидкої ампліфікації MIRA, які використовувалися в цьому дослідженні, були надані компанією Amp‑Future (Changzhou) Biotech Co., Ltd. Окрім чудових характеристик реагентів, Amp‑future Biotech також пропонує професійну та швидко реагуючу команду технічної підтримки.

MIRA демонструє надійну сумісність із центрифужними-мікрофлюїдними чіпами, розробленими для досліджень і діагностики:

1. Мініатюрна реакційна система, яка підходить для мікро-реакційних камер, характерних для мікрофлюїдних чіпів;
2. Можливість мультиплексного виявлення за один цикл;
3. Сумісність із портативними пристроями, плавний робочий процес від зразка до результату.

Портативний аналізатор і архітектура мікросхеми.

(A) Деталізований вигляд портативного пристрою виявлення, що показує основні компоненти. (B) Модульна архітектура відцентрового мікрофлюїдного чіпа. (C) Контроль рідини за допомогою центрифугування. Аналіз траєкторій транспортування рідини під дією програмованих відцентрових сил.

ми розробили інтегрований портативний пристрій для тестування (POCT), оптимізований для польового застосування, як показано на мал. . 4A. Компактний прототип (23 см (Д) × 21 см (Ш) × 14 см (В), загальна маса 12,5 кг) забезпечує виняткову мобільність. До основних компонентів системи належать високо{11}}точний серводвигун для точного керування обертанням і блок нагріву повітря для регулювання температури. Вбудований оптичний модуль виявлення, розташований під чіпом, полегшує збудження флуоресценції та вимірювання, забезпечуючи високу чутливість і точність виявлення. Портативний пристрій оснащено вбудованою операційною системою Android із дружнім-інтерфейсом, де оператори можуть вибирати попередньо запрограмовані робочі файли, що містять детальні параметри, такі як час реакції та температура. Результати та висновки відображаються в реальному{16}}часі на рідкокристалічному екрані, що забезпечує швидкий збір інформації. Крім того, система містить модуль бездротового зв’язку, який підтримує передачу даних у реальному-часі на мобільні пристрої або хмарні сервери, інтегруючись із алгоритмами штучного інтелекту для негайної інтерпретації та аналізу результатів тесту.

news-800-847

Щоб оцінити здатність системи MaC14a виявляти вірусоносійство у комах-переносників, ми провели аналізи отримання TYLCV за допомогою

Популяції Bemisia tabaci. Білокрилкам дозволили 3-денний період годування на заражених TYLCV рослинах, а потім обробили через

Система MaC14a (рис. D). Подальший аналіз показав, що 8 із 10 перевірених білокрилок (80%) демонстрували позитивні вірусні сигнали (рис. E). Важливо, що всі зразки з когорти негативного контролю (які годували виключно здоровими рослинами) підтримували базові рівні флуоресценції. Ці результати демонструють, що система MaC14a може точно ідентифікувати вірус-білокрилок на індивідуальному рівні, підкреслюючи їхній потенціал для моніторингу та контролю передачі вірусу в сільськогосподарських умовах.

У наступному експерименті з подвійною-сліпою перевіркою ми протестували 20 зразків листя томатів (S1–S20), зібраних із двох тепличних зон культивування в Ханчжоу, провінція Чжецзян, Китай, і двох теплицьзони вирощування в Наннін, провінція Гуансі, Китай. Кожна зонанадав п’ять зразків листя томатів, що демонструють типові симптоми вірусуінфекції (такі як хлороз, мозаїчна плямистість і скручування листя) і п'ятьбілокрилки (всього 20). Система MaC14a, удосконалена штучним інтелектом-, створена повторнорезультати на 5-й хвилині, які повністю відповідали отриманимз 60-хвилинного аналізу aMIRA-Cas14a та платформи qPCR, демонструючи100% згода (рис. F, S6-S7, таблиця S3). Крім того, вірусвиди, виявлені у зразках рослин, дуже відповідали цимідентифіковані у комах-переносників з тієї ж зони культивування. Цірезультати підкреслюють значний потенціал MaC14a-з підтримкою штучного інтелекту в-Діагностика вірусів на ділянці рослин, досягаючи високої швидкості (від нуклеїнової кислотивилучення результату зчитування всього за 10 хвилин), висока точність (послідовназ результатами КПЦР) і портативність.

Поширення статей丨Покращена-ШІ мікрофлюїдна платформа CRISPR-Cas14a для точного-виявлення гемінівірусів у рослинах помідорів і білокрилок на місці