Помітне та швидке виявлення котячого чафамапарвовірусу за допомогою багатоферментної ізотермічної швидкої ампліфікації та тесту на бічній смужці
Журнал:Frontiers у клітинній та інфекційній мікробіології
Імпакт-фактор:4.6
Чафамапарвовірус котів(FeChPV)це новий парвовірус, вперше виявлений у котів з діареєю в Канаді в 2019 році. Його патогенність і молекулярні характеристики залишаються неясними, і він демонструє різноманіття хазяїв і генетичне розмаїття, що вимагає подальшого епідеміологічного дослідження. Наразі не існує стандартизованого методу виявлення FeChPV.
Багатоферментний ізотермічний метод швидкої ампліфікації-бічного потоку вимірювальної смужки (MIRA-LFD)успішно використовується для виявлення різних вірусів, пропонуючи такі переваги, як швидкість, простота та відсутність потреби у точних приладах. Дослідницька група розробила метод MIRA-LFD, придатний для FeChPV для вирішення проблем у масовому клінічному виявленні. Не покладаючись на точні прилади,метод MIRA-LFD завершив виявлення FeChPV при 37 градусах протягом 20 хвилин і не виявив перехресної-реактивності з іншими вірусами. Межа виявлення становила 32,3 копій/мкл,В 10 разів перевищує метод ПЛР. Крім того, метод MIRA-LFD виявив 29 FeChPV-позитивних зразків серед 417 котів з діареєю, причому рівень позитивності трохи вищий, ніж у методі вкладеної ПЛР. Ці результати вказують на те, що встановлений метод MIRA-LFD для виявлення FeChPV є ефективним, економічним, надійним і простим методом, який сприяє ранній профілактиці та контролю за інфекцією FeChPV.
1. Експериментальні методи
Клінічні зразки:Зразки ректальних мазків, використаних у цьому дослідженні, були зібрані у 632 котів (включаючи 417 з діареєю та 115 здорових котів) і 474 собак (включаючи 342 з діареєю та 132 здорових собак) у ветеринарних клініках провінцій Гуандун, Хенань, Аньхой, Чжецзян і автономного району Внутрішня Монголія між 2022 та 2024 роки.
Ампліфікація нуклеїнових кислот:Екстраговану нуклеїнову кислоту ДНК додавали до системи MIRA. Рекомбіназа і праймери утворили комплекс; за допомогою допоміжних білків і білків, що зв’язують одноланцюгові-ланцюги, вони проникли в шаблон дволанцюгової-ДНК. Праймери зв’язувалися з гомологічними комплементарними ділянками, утворюючи область петлі D-, тоді як рекомбіназа відокремлювалася від комплексу. Полімераза зв'язувалася з 3'-кінцем праймерів і ініціювала синтез ДНК, експоненціально посилюючи цільову область на матриці. Цей процес відбувався швидко й ефективно, завдяки чому досягалося надшвидкої ампліфікації цільового фрагмента всього за 15 хвилин.
Розробка кольору тест-смужки:Продукт ампліфікації нуклеїнової кислоти розводили 1:10, наносили на тест-смужку та зчитували результати через 5 хвилин.
Весь процес від ампліфікації нуклеїнової кислоти до появи кольору тест-смужки займав лише 20 хвилин.
В експерименті використовували -біологічні продукти майбутнього:
У дослідженні було перевірено чотири розроблені набори конкретних комбінацій праймерів-зондів. Для представлення результатів використовували електрофорез у агарозному гелі та тест-смужки на нуклеїнові кислоти. Усі чотири комбінації праймерів-зондів можуть виявити вірус FeChPV. Згідно з результатами електрофорезу в агарозному гелі, комбінація FeChPV-4 показала найяскравішу цільову смугу, тому цю комбінацію було обрано для подальшого тестування.
Згідно з результатами електрофорезу в агарозному гелі, ампліфікація протягом 5, 10, 15 і 20 хвилин давала цільову смугу. Інтенсивність цільової смуги досягала максимуму через 15 хвилин ампліфікації, встановлюючи 15 хвилин як оптимальний час реакції для цього аналізу. Ампліфікація при 36 градусах, 37 градусах, 38 градусах, 39 градусах і 40 градусах утворювала цільову смугу, причому найяскравіша смуга спостерігалася при 39 градусах, встановлюючи 39 градусів як оптимальну температуру реакції для цього аналізу.
(Рис. A: 1: Посилення 5 хв; 2: Посилення 10 хв; 3: Посилення 15 хв; 4: Посилення 20 хв) (Мал. B: 1: Посилення 36 градусів; 2: Посилення 37 градусів; 3: Посилення 38 градусів; 4: Посилення 39 градусів; 5: Посилення 40 градусів)
2. Ефективність виявлення
Чутливість:
(Малюнок A: результати MIRA, представлені за допомогою електрофорезу в агарозному гелі)
(Малюнок B: вкладені результати ПЛР, представлені за допомогою електрофорезу в агарозному гелі)
(Малюнок C: результати MIRA, представлені з використанням тест-смужок на нуклеїнову кислоту)
Зразки піддавали 10-кратним серійним розведенням, починаючи з 3,23×10⁶ копій/мкл. Вкладена ПЛР з електрофорезом у агарозному гелі могла стабільно виявляти 3,23×10² копій/мкл; MIRA з електрофорезом у агарозному гелі та MIRA з тест-смужками на нуклеїнову кислоту можуть стабільно виявляти 3,23×10¹ копій/мкл.
Метод MIRA продемонстрував стабільну чутливість, використовуючи два різні формати представлення результатів, і чутливість методу MIRA була вищою за чутливість вкладеної ПЛР.
Специфіка:
(1: FeChPV, котячий чафамапарвовірус; 2: FPV, вірус панлейкопенії котів; 3: FeAstV, котячий астровірус; 4: FBoV, котячий бокавірус; 5: CachaV, собачий чапарвовірус; 6: негативний контроль)
Нещодавно створений метод MIRA-LFD виявив лише FeChPV і не виявив перехресної-реактивності з іншими еталонними вірусами, що вказує на добру специфічність.
3. Підсумок дослідження
Це дослідження створило метод MIRA-LFD для виявлення FeChPV без потреби в-високоточних приладах. Як ефективний, економічний і надійний метод виявлення з високою чутливістю та специфічністю, метод MIRA-LFD більше підходить для клінічного виявлення, надаючи технічну підтримку для ранньої профілактики та контролю інфекції FeChPV.
4.AMP-БІОТЕХНІКА МАЙБУТНЬОГО
Мультиферментна ізотермічна швидка ампліфікація нуклеїнових кислот MIRA – це технологія, яка справді забезпечує швидке виявлення на місці-.
Технологія MIRA базується на механізмі відновлення рекомбінації генів in vivo, який спирається на синергетичну дію багатьох функціональних білків при кімнатній температурі для досягнення швидкої (5-20 хв), чутливої, специфічної та безпечної ампліфікації нуклеїнових кислот при кімнатній температурі (25 градусів –45 градусів). Завдяки ізотермічній природі технології MIRA вона має низькі вимоги до обладнання та просту експлуатацію. Завдяки мініатюрним портативним пристроям його можна застосовувати для тестування на першому місці в різних сценаріях застосування, забезпечуючи швидке й точне тестування нуклеїнової кислоти в таких налаштуваннях, як POCT, домашнє тестування, сільськогосподарські поля та-правоохоронні органи на місці. На основі технології MIRA компанія Amp-future Biotech розробила серію продуктів для швидкого тестування на місці-, включаючи агенти швидкого вивільнення нуклеїнових кислот, ізотермічні реагенти для швидкої ампліфікації нуклеїнових кислот, тест-смужки з колоїдним золотом і мініатюрне портативне обладнання, створюючи загальне рішення для-швидкого молекулярного тестування на місці. Крім того, технологія MIRA від Amp-future пропонує переваги застосування в поєднанні з технологією CRISPR, NGS, SNP, мікрофлюїдикою тощо.
Окрім серії -наведених вище продуктів швидкого тестування на місці, Amp-future Biotech також надає:
Дослідницькі реагенти:Забезпечення реактивної сировини та технічного забезпечення фундаментальних наукових досліджень, а також довідкової літератури проекту.
Виробництво OEM:Здатність самостійно виробляти готову продукцію високої-чистоти та високої{1}}активності протягом усього процесу, досягаючи промислового{2}}виробництва.
Розробка проекту на замовлення:Інформація про послідовність і результати аналізу вирівнювання послідовностей, дизайн і синтез праймера-зонда проекту, синтез плазміди проекту та зразки, звіти про проект і результати тощо.
Для отримання додаткової інформації, ласкаво просимо запитати.