У статті пропонується нова мікрофлюїдна технологія чіпів для мультиплексного виявлення патогенних мікроорганізмів креветок. Дослідницька група інтегрована з багатоотермічною технологією ампліфікації швидкої нуклеїнової кислоти (MIRA) та методами виявлення флуоресценції в режимі реального часу. Цей мікрофлюїдний мікросхема забезпечує швидке, чутливе та ефективне рішення для виявлення основних збудників креветок.
Дослідження та значення
Глобальна промисловість креветок є однією з найважливіших економічних компонентів аквакультури, але галузь давно стикається з різними патогенними мікроорганізмами. Ці збудники часто призводять до масштабної загибелі креветок, серйозно впливаючи на виробництво та економічні вигоди. Включаючи гостру хворобу некрозу (AHPND), вірус синдрому білого плями (WSSV), інфекційний гіпердермальний та гемопоетичний вірус некрозу (IHHNV), гемоцита креветів Ірідовірусу (Shiv) та Enterohepaticus (EHP) і тощо.
Традиційні методи виявлення збудника, такі як полімеразна ланцюгова реакція (технологія ПЛР), мають високу чутливість та специфічність, але складні для роботи, тривалий час і покладаються на лабораторне обладнання. Ці обмеження роблять технологію ПЛР непридатними для швидкого тестування на місці. Технологія MIRA стала інструментом молекулярного виявлення, придатним для застосування на місці завдяки його швидкому ампліфікаційному характеристиках при постійній температурі та нормальній температурі.
Принцип технології Міри
Мультизайми постійної температури швидкої технології ампліфікації нуклеїнової кислоти (Mira Technology)-це технологія ампліфікації постійної температури, яка покладається на синергію численних функціональних білків при кімнатній температурі для досягнення швидкої ампліфікації нуклеїнових кислот. Це справді портативна технологія виявлення швидкого виявлення нуклеїнової кислоти на місці. У порівнянні з ПЛР, Mira має більше переваг.
Дизайн та інновації мікрофлюїдних мікросхем
Схематична схема платформи виявлення RPA на чіпі для декількох важливих патогенних мікроорганізмів креветок
(A) Структура мікрофлюїдного мікросхеми диска. 1: Реакційна камера; 2: кульовий клапан; 3: Випускний порт; 4: порт відбору проб;
(B) вибухнув вигляд. 5: Плівка для ущільнення тепла; 6: Підкладка мікросхеми.
(C) Детальний макет шести наборів праймерів у секторі. Кожен набір праймерів заздалегідь зафіксований у позначеній реакційній камері.
(D) Повна робоча процедура на платформі виявлення RPA-мікросхеми.
У статті пропонується мікрофлюїдний чіп, інтегрований з технологією Mira для мультиплексного виявлення патогенних мікроорганізмів креветок. Мікрофлюїдна технологія може контролювати рідини в межах каналів на рівні мікрона для точного маніпуляції, тим самим досягаючи ефективного та недорогого багатоцільового виявлення.
Чіп має такі функції дизайну ключів:
● Відцентрова мікрофлюїдна мікросхема
Чіп приймає відцентрову конструкцію приводу, використовуючи відцентрову силу, щоб рівномірно розподілити зразок у кожну реакційну камеру. Ця конструкція спрощує процес експлуатації, і оператор може завершити всю реакцію, просто ввівши зразок.
● Багатоцільне виявлення
Чіп заздалегідь вводиться з типами бактерій, які потрібно виявити: гострий нектопанкреатичний некроз (V-AHPND), вірус синдрому білих плям (WSSV), інфекційний вірус підшкірного некрозу (IHHNV), гемоцитарні креветки (ehpaTica (ehpapica). ) Зонди праймерів для п’яти збудників. Ця конструкція може одночасно виявляти шість цілей генів в одній реакції, що дозволяє швидко обстежувати кілька збудників.
● Виявлення флуоресценції в режимі реального часу
Реакція ампліфікації технології MIRA в мікросхемі поєднується з флуоресцентним зондом, який може контролювати хід реакції ампліфікації в режимі реального часу. Конструкція зонда дозволяє вивільняти флуоресцентний сигнал лише тоді, коли продукт ампліфікації генерується, таким чином, досягаючи швидкого та чутливого кількісного виявлення.
● Система реакцій з низькою концентрацією
Кожна реакційна одиниця мікросхеми потребує лише об'єму реакції 5 мкл, що значно знижує споживання реагенту. Коли вся система працює, можна одночасно обробляти до чотирьох зразків, і кожен зразок може виявити п’ять збудників, значно підвищуючи ефективність виявлення.
Чутливість, специфічність та повторюваність
Продуктивність системи мікросхеми включає виявлення симетрії, резонансу та повторюваності.
● Чутливість
Експериментальні результати показують, що мікросхема може виявити цільові числа копій гена до 10 копій/мкл, з чутливістю, порівнянною або навіть вищою, ніж традиційні методи ПЛР. Ця висока чутливість гарантує, що технологія може виявити ранніх інфікованих осіб у практичному застосуванні, тим самим забезпечуючи ранній скринінг збудників.
● Специфіка
Експеримент провів тести на перехресну реакцію на різних нецільових збудниках, і результати показали, що мікросхема є дуже специфічним для цільових збудників і може точно розрізняти різні типи збудників. Усі тести гострої хвороби некрозу гепатопанкреатичного некрозу (V-AHPND), вірус синдрому білого плями (WSSV), інфекційного гіподермального та гематопоетичного некрозу (IHHNV), кремум-гемацитарного вірусу (Shiv) та ентерогефатиту, що не діє, не впливають на те, що не впливають на те, що не впливають на метод, не впливають на метод, не впливають на метод, не впливають на метод, що не потребує методів, що не потребують, ніякове метод, що уникає, не діє на метод, що уникає, не вникає у некопину ампліфікація.
● Повторюваність
Для того, щоб оцінити стабільність методу, дослідницька група провела кілька повторних експериментів. Результати показали, що коефіцієнт варіації (значення CV) між різними експериментами становив менше 10%, що демонструє хорошу експериментальну повторюваність та послідовність.
Польові програми та переваги
Дизайн мікрофлюїдної мікросхеми Mira Technology дає йому значні переваги на польових застосувань, особливо придатні для швидкого виявлення та моніторингу збудників патогенів:
● Зручний процес експлуатації
Весь процес виявлення вимагає лише введення зразка в мікросхему та запуску реакційного пристрою. Це майже не вимагає ручної роботи і підходить для непрофесіоналів на місці.
● Можливість швидкої відповіді
Система може отримати результати тестів протягом 20 хвилин, значно скорочуючи час тесту. Це має вирішальне значення для швидкої реакції на захворювання на фермах та зменшення поширення збудників збудників.
● Можливість виявлення мультиплексу
П'ять основних збудників можна визначити в одному тесті, що значно покращує ефективність виявлення та економить витрати та час виявлення.
Перспективи технології Міри
Незважаючи на те, що технологія ПЛР вже давно оцінюється як золотий стандарт для виявлення ампліфікації нуклеїнової кислоти, Mira Technology продемонструвала великий потенціал застосування завдяки швидкій реакції при постійній температурі, простої експлуатації та низьких вимог до обладнання. Порівнюючи з ПЛР у поєднанні з секвенуванням ДНК, було встановлено, що результати виявлення мікросхеми ізотермічної ампліфікації узгоджуються з результатами ПЛР з точки зору чутливості та специфічності, а час реакції технології MIRA значно скорочується. Таким чином, мікрофлюїдні мікросхеми Mira Technology вважаються технологією, більш придатною для польових застосувань, особливо в середовищах, які потребують швидкого та масштабного виявлення збудника.
Мікрофлюїдні мікросхеми на основі багатоотермічної технології ампліфікації ізотермічної швидкої нуклеїнової кислоти (MIRA) забезпечують ефективний інструмент для виявлення патогенних мікроорганізмів у землеробстві. Ця технологія має переваги високої чутливості, хорошої специфіки, легкої експлуатації та швидкої швидкості виявлення та має широкі перспективи застосування в профілактиці та контролі захворювань аквакультури. Завдяки подальшому розвитку та оптимізації технології, очікується, що система буде застосована до виявлення більш водних збудників, що дозволяє профілактику та моніторинг захворювань.
Результати досліджень забезпечують надійний метод раннього виявлення для промисловості аквакультури, який може ефективно знизити ризик спалахів захворювань, підвищити ефективність виробництва та виробництво ферм та закласти технічну основу для сталого розвитку галузі аквакультури.