Регульований контроль активності Cas12 сприяє універсальному та швидкому-виявленню нуклеїнової кислоти
Видавець: Університет науки і техніки Китаю
Журнал: Nature Communications
Імпакт-фактор: 14,7
Використовуючи технологію MIRA, було розроблено універсальний-метод виявлення нуклеїнових кислот (SURVEY) на основі гепарину натрію. Дослідження показали, що гепарин натрію може регулювати активність розщеплення Cas12a, перешкоджаючи процесу зв’язування Cas12a-crRNA. Регулюючи концентрацію гепарину натрію, SURVEY сумісний як з класичними, так і з субоптимальними послідовностями PAM і застосовний до кількох підтипів Cas12. Цей метод із часом виявлення лише 15-20 хвилин забезпечує чутливість і специфічність понад 95% для виявлення псевдовірусу віспи мавп, вірусу грипу А та SARS-CoV-2. Це низька -вартість і забезпечує новий метод виявлення на місці надання медичної допомоги для медичної діагностики та моніторингу навколишнього середовища, вирішуючи складний баланс між чутливістю та специфічністю традиційної діагностики CRISPR.
1. Дослідження механізму дії гепарину натрію
Флуоресцентний зонд додали до системи Cas12a-crRNA, що містить 10 нМ цільової ДНК, і спостерігали швидкий і значний флуоресцентний сигнал без додавання гепарину натрію. Коли додавали 0,2 мкг/мл гепарину натрію, флуоресцентний сигнал був подібним до сигналу контрольної групи, що вказувало на те, що гепарин натрію значно пригнічував активність транс-розщеплення Cas12a. 0.2мкг/мл гепарину натрію — мінімальна інгібуюча концентрація. Коли концентрація гепарину натрію підвищується від 0,2 мкг/мл до 0,5 мкг/мл, активність цис-розщеплення Cas12a поступово пригнічується, а при 0,5 мкг/мл активність транс-розщеплення майже повністю інгібується. Дослідження механізму дії гепарину натрію показали, що негативно заряджені групи гепарину натрію заважають правильному зв’язуванню crRNA з Cas12a і можуть впливати на утворення бінарного комплексу crRNACas12a.
- MIRA-Cas12a one-виявлення горщика
Після підтвердження механізму дії гепарину натрію в статті досліджено стратегію виявлення в одній-базі (MIRA-Cas12a), яка поєднує ампліфікацію MIRA та виявлення флуоресценції, опосередкованої Cas12a-, в одній пробірці.
За відсутності гепарину натрію комбінація MIRA-Cas12a не виробляла значного флуоресцентного сигналу в діапазоні концентрації цільового гена від 0,1 мкМ до 10 фМ. При 40 мкг/мл гепарину натрію спостерігався значний сигнал флуоресценції в цільовому діапазоні концентрацій від 1 мкМ (≈0,6 копій/мкл, об’єм=30 мкл) до 10 фМ (≈6000 копій/мкл, об’єм=30 мкл), демонструючи більш ніж 10 000-кратне покращення чутливості виявлення порівняно з системою без гепарину натрію.
Концентрація матриці вірусу віспи мавп становила 10 фМ, і Cas12a-crRNA (100 нМ) використовували для виявлення цільових генів f31 і b6r. Реакцію ампліфікації припиняли через 0, 2, 4, 6, 8, 12, 16 і 20 хвилин, і вміст продукту ампліфікації MIRA в різний час аналізували на агарозних гелях. Потім отримані продукти аналізували на агарозних гелях у трьох різних налаштуваннях: MIRA-гепарин натрію без Cas12a, MIRA-Cas12a без гепарину натрію та MIRA-Cas12a з гепарином натрію. Результати показали, що за відсутності гепарину натрію ампліфікація нуклеїнової кислоти була перешкоджана через високу цис-активність розщеплення Cas12a. Однак додавання гепарину натрію значно збільшило ампліфікацію нуклеїнових кислот через зниження активності цис-розщеплення Cas12a.
Стаття демонструє, що універсальний-метод виявлення нуклеїнової кислоти флуоресцентної ємності (SURVEY) на основі гепарину натрію може бути досягнутий за допомогою класичних PAM і субоптимальних послідовностей PAM. Крім того, крім LbCas12a, AsCas12a і AapCas12b також широко використовуються в методах CRISPR-Dx. У системі з використанням MIRA-AsCas12a флуоресценція спостерігалася лише в присутності 40 мкг/мл гепарину натрію, що вказує на те, що вона може виявити 1fM генів f31 і b6r. За відсутності гепарину натрію MIRA-AapCas12b може виявити 1 ген f31 і b6r. Введення 20 мкг/мл гепарину натрію не тільки прискорило швидкість виявлення MIRA-AapCas12b, але й підвищило інтенсивність флуоресценції. Ці результати вказують на те, що метод-одного горщика, розроблений із застосуванням дозування гепарину натрію, також застосовний до інших підтипів Cas12.
